博科访谈会（三十九）：关于新冠疫苗的二三事第二篇

历史访谈：以下保留原稿中的研究经历与个人观点。

2020年3月16日，由Moderna与美国国立卫生研究院合作推进的mRNA-1273一期临床试验开始首位受试者接种，mRNA新冠疫苗也开始走入了大众的视野。mRNA新冠疫苗究竟是何方神圣？mRNA新冠疫苗的研发需要破解哪些技术难点？

本期，就让我们一起走进疫苗技术的“后起之秀”—mRNA疫苗。

新冠病毒疫苗新秀—mRNA疫苗

关于现在风很大的mRNA疫苗，大家可以简单介绍一下mRNA疫苗的研发历史吗？mRNA疫苗研发过程中有哪些技术难点？

EM：其实mRNA疫苗如果你仔细去阅读它的历史的话，它的起源是非常早的。20世纪90年代mRNA在活体或者细胞中就有实现一个表达，1990年已有小鼠体内表达的原始研究；不能把1990年仅归为体外、1991年归为体内。但是那种线路最早都是没有载体的，你可以看到很多早期的文章，绝大多数都是局限于肿瘤的研究方向。像UPenn还有UC系统等等那些教授，前期基本上都是做肿瘤的，没有任何载体，比如说直接把mRNA注射到小鼠的皮内或者是皮下，通过这种表达方式看系统能不能表达。

早期发现的问题还是非常明显的，因为RNA不稳定，所以表达水平非常低。Pieter Cullis等研究者长期推进脂质递送系统，包括用于核酸递送的脂质材料；2005年Karikó与Weissman的重要进展则是mRNA核苷修饰，不能把这两类贡献混为一件事。这种材料和你的mRNA结合之后，会出现这种载体的形式，实现mRNA的递送。后面像BioNTech，还有Moderna公司陆续成立。最早的方向跟很多核酸类递送大同小异，比如说siRNA (小干扰RNA分子)一样的，你还是需要一个载体。

多数人发现如果你没有载体或载体的递送效率比较低的话，你可以实现的蛋白表达或者想激起的机体免疫都达不到预期效果，这是主要问题。慢慢的像LNP脂质材料被应用到核酸，Moderna于2010年成立时即以mRNA技术为方向，不能概括为一直做siRNA，但是它在2010年之后，原稿提到与MIT的Robert Langer、Daniel Anderson等研究者相关的工作，但未提供资金分配依据，不能据此认定其多数资金给了MIT，那段时间你会发现各式各样的阳离子这种LNP系统就出现了，出现了很多的基于LNP的一些递送。

现在出现了很多类似Moderna的公司，像Arcturus Therapeutics、Ethris、Curevac这种公司采用各自的RNA与递送技术路线，不能把它们都概括为先递送miRNA再转向mRNA，像BioNTech的Katalin Karikó还有宾夕法尼亚大学的Drew Weissman，他们对此做出了奠基性的贡献，今年一度也成为了诺贝尔奖的热门候选人。

历史进展说明：原稿保留当时“诺贝尔奖热门候选人”的表述；Karikó与Weissman后来获得2023年诺贝尔生理学或医学奖。

Eureka：mRNA其实是在历史上被很早就被给大家发现了。生物学有一个中心法则，就是说从DNA再到RNA再到蛋白质的转录翻译表达过程，我相信大家只要上过中学都听说过。mRNA作为中心法则中很重要的一环，其实大家很早就注意到了它。在大概1978年就是70年代末期的时候，大家就已经开始尝试用mRNA转染小鼠或者是人类的细胞，在体外中诱导mRNA在目标细胞中进行蛋白质的表达。

但是限于那个年代的科技水平，体外制备、递送和提纯适合表达的mRNA仍有很大技术限制，不能笼统说当时全世界都无法人工合成DNA或RNA。所以那个时候大家直接就地取材，从动物的细胞中提取到mRNA来做这个实验，可想而知当时的提纯的条件也不够，肯定效果也不是很好，可能只有零零散散的会看到一点点mRNA能够成功的在体外细胞中表达。

但是到了八十年代中期，这个情况就有所改变了，当时有两个科学家，一个叫Krieg，然后还有一个叫Douglas Melton，他们开始用SP6 RNA聚合酶，还有其他的材料，于1984年报道通过体外转录制备有活性的mRNA，这个方法一直沿用至今，成为经典的路线。

不过，虽然他们可以自主合成mRNA来做实验，确还没有意识到mRNA可以用来做疫苗。再之后，到了80年代末的时候，Robert Malone、Philip Felgner与Inder Verma等于1989年发表了重要的RNA转染研究，他把mRNA跟脂质体混合之后，发现了这个系统好像可以成功让细胞摄取mRNA，继而成功表达蛋白质，他就意识到了原来我们可以这样的主动地去做，让细胞利用脂质体递送进来的mRNA表达出人设计的蛋白质序列，那么mRNA就极有可能作为一种治疗药物，然后推广开来。

他后来还做了一个很重要的实验，就是把mRNA送到了青蛙胚胎中，这是mRNA发展历史上非常浓墨重彩的一笔。但是在这之后，大家在一窝蜂地去尝试这个路线的时候，发现这个方法好像不是很稳定，同时它价格又非常贵。在做实验的时候，经常因为递送系统的限制而导致实验失败。

上述Malone、Felgner与Verma的1989年研究采用了带正电荷脂质组成的脂质体，这个材料的出现基大大地增强了mRNA与载体结合的能力，提高了这个mRNA的稳定性，递送能力也有非常里程碑式的提高。到了这里，我们基本可以说说mRNA疫苗的雏形已经有了，后面很多的商业化的进展也开始了。

在这之后，还有一个比较重要的技术上的里程碑，是加拿大的不列颠哥伦比亚大学大学的一个教授，叫Pieter Cullis，他极大程度上发展并且完善了脂质纳米颗粒（LNP）核酸递送系统，包括相关封装系统的经典配方路线还有整个的递送系统的封装技术。有了这些科学家和企业家的不断的努力，才形成了我们世界上现在通用的mRNA疫苗。

现在回头看看，mRNA疫苗的发展历程其实是一个非常漫长、曲折、类似英雄史诗的一个过程。

阿桐木：我补充一个小故事，关于我们mRNA疫苗研发最初是用来治疗什么疾病的。其实2013年的时候，已有针对狂犬病的mRNA疫苗人体一期试验，不能笼统当作所有mRNA疫苗的首次人体临床试验，不知道大家有没有被狗咬过，我小时候是被咬过一次，咬过之后会被打好像是5针还是6针，那个时候应该是灭活疫苗。

这里提到的早期狂犬病mRNA临床实验是德国的CureVac公司进行地，但是它第一次临床实验的效果并不是很好，一直拖到2018年它才开始第二次的临床实验。

很有意思的是我在官网上查了一下，第二次临床实验要到2023年才会出结果，所以说它是第一个开始做临床实验的，但是到现在为止这个药物还没有真正的问世。

mRNA疫苗包裹和递送的过程的原理是什么？

EM：原理的话，从最早就是脂质体这个东西来说的话，以前老的脂质体，一般都是说一组分二组分这种比较经典的，比如说那种天然的一些磷脂类的，它可以形成一种比较经典的磷脂双分子层的纳米结构。这种组分都已经有不少的上市的产品了，但是你想siRNA或者mRNA它是带负电的，用这种老的一组分二组分是没有办法实现比较高的包裹效率的。

所以科学家引入了阳离子脂质体（cationiclipid），这种脂质材料它是带正电的，就是说你在形成纳米结构结构之前，相当于带正电的脂质材料它可以和带负电的形成一定的包裹，所以说它可以实现一个比较高的效率。

早期做阳离子脂质体这一块，最主要一个问题是没有办法在药效和毒性中做一个比较好的兼顾，因为阳离子的正电性会对细胞带来潜在的毒性损害。所以说可能在2007、2008或者更早之前就出现了很多这种可离子化阳离子（ionizable lipid）。电荷会随具体脂质的pKa及环境pH变化，接近生理pH时可较少带电，在较酸条件下增加正电；不能把pH 6视为所有材料的固定开关。所以说我们可以利用这一点来有效降低它的毒性，同时又可以兼顾药效，这样真正可以成药了。

这一块早期都是基于都是在实现在siRNA的一些递送，像Moderna还有Pieter Cullis，早期就是这几家公司或者是个人把整个行业的基础给打好，再慢慢优化，最后演化成现在的这种已经上市的一些可离子化阳离子，比如说MC3，包括还有Moderna他们自己开发的SM-102等等，可以说可离子化阳离子地进步就是载体的一个进步。

阿桐木：1995年获批的脂质体药物是DOXIL（脂质体多柔比星），不是Cablivi。Cablivi的活性成分caplacizumab是抗体片段，美国于2019年批准，并非上述脂质体封装药物。脂质体药物的发展，这个发现的话就给我们现在的 mRNA疫苗技术提供了一个很好的模板。现在除了脂质体之外，科学家们也在研究其他的一些包裹材料，让它能有更好的破膜穿膜效果，同时提供更好的生物安全性。

现在其实在整个载体的研发过程中，药物包裹技术中的微流控技术也非常的火爆，整个包裹过程如果能够实现精确的控制，疫苗生产的稳定性也会大幅提高。因为我们知道脂质体在包裹过程中是一个自发组装的过程，如果用传统的混合的方式的话，很多因素是不可控的，但如果你从一个普通混合方式变成一个微流方式，很多条件都可以在一个微环境中控制，最终的疫苗的稳定性，还有其他的包裹条件会更优，此外我们还能控制它的大小等等。

原稿配图：Cablivi（抗体片段药物，与1995年的DOXIL脂质体药物不同）

mRNA疫苗的独特优势

为什么mRNA疫苗现在这么被大家所认可，被科学界所看好？

EM：其实如果说的比较简单一点，就是简单快速推进，感觉mRNA时代也到了。mRNA的稳定性，它的早期的指令构建，到IVT到脂质体包裹，这些都需要有相应的工厂能够实现这个东西，不是说简单的在实验室试验就行，你需要有工业化生产的配合。

一些早期的疫苗，比如说灭活疫苗减活疫苗，它的开发的周期按照以前的一些标准其实和做新药研发是差不多的，周期很长的，一般是6~10年。

mRNA的话，哪怕说你现在获得了编码spike protein（刺突蛋白）的基因序列，就可设计相应mRNA；仅知道蛋白结构并不能唯一反推出其核酸序列，再做一定的优化，然后做成它可以表达出来成为spike protein的的形式。这一块已经有不同的科学家在做，从理论上来说它整个来说它的开发来说是非常快的。

相对其他路线的话mRNA疫苗还是比较快速，而且它就是scale up（放大生产）的话，有个好处是因为因为现在注射量相对比较少，比如说像BNT它们是30微克的mRNA用量，Moderna是100微克的mRNA用量，这些是早期特定产品的剂量，不代表所有年龄或后续制剂。仅凭“50升原液”而没有浓度、纯度和损耗，不能算出20亿人两针是否足够，相比需培养病毒的技术路线，mRNA体外转录不需要培养活病毒；灭活是灭活疫苗的步骤，不能与减毒活疫苗混为一谈，相对来说mRNA有很多天然、独到的优势。

Eureka：我觉得mRNA疫苗现在之所以被这么多人关注，是因为大家现在通过新冠疫情的风口，发现了它相比于传统的灭活减毒的疫苗的一个非常巨大的优势，即它们的作用机理是完全不一样的。传统的灭活的疫苗首先是要病毒株分离，然后提纯化，还要非常小心地杀死再递送到人体之内。

其实灭活疫苗历史上是出过非常多的娄子，比如说上世纪50年代，美国的脊髓灰质的疫苗，发生Cutter事件，部分含未完全灭活病毒的批次造成疾病、瘫痪和死亡；不能说数十万儿童都因此出现严重疾病或死亡。所以灭活疫苗在西方国家其实是有惨痛的历史教训的。

而mRNA疫苗和灭活病毒不一样，首先是它不把任何真正的病毒成分递送到人体内，它其实是把一段病毒的s蛋白序列的一部分以mRNA编码的形式递送到人体，之后在人体细胞内诱导表达出s的抗原，所以说相比于灭活病毒整个把病毒递送到人体内这种方式来说，mRNA不需递送完整病毒，但不同产品安全性仍需证据比较。同时它的普适性非常的广，因为理论上说既然它是可以表达成蛋白质，相当于mRNA可用于研究多种蛋白相关疾病，但研究潜力不等于已有治疗办法，也不是所有疾病应用都属于疫苗。比如说老年痴呆症也好，或者帕金森，甚至是糖尿病胰岛素的缺乏的问题，这些都是需要具体研究和临床验证的方向，不能保证mRNA能解决所有蛋白相关疾病。

这相当于说说你缺什么蛋白质，我就往里面递送一段mRNA的基因帮你合成蛋白质，如果你蛋白质过度表达的话，可研究其他核酸或调控策略，但基因沉默不能直接等同于普通mRNA疫苗，所以说这个方法是非常普适的一个方法，所以它得到了非常大的关注。现在世界上各个国家和药企的mRNA赛道已经全面铺开了，不管是肿瘤还是心血管疾病还是罕见病也好，大家都在紧锣密鼓地铺设各种的临床的管线，再加上mRNA的疫苗的生产标准虽然说也很严格，但是相比于灭活病毒来说，其实还是要轻松一些的，像美国历史上是自己就发生过很多次灭活疫苗灭活不彻底，或者生产中的纯化问题，产生了很多的安全问题，但是在mRNA的疫苗生产过程中，体外转录不需培养活病毒，但模板制备、纯化、封装与质量控制仍然严格，不能当作普通化学品生产。

所以这一点避免活病毒生产是一项特点，但不能据此作所有产品都安全的保证，这就是为什么西方国家愿意大力推广mRNA的疫苗，不过各地平台选择也涉及具体证据、供应和政策，不能归为单一原因。

阿桐木：其实我觉得用一句话来讲的话，核酸疫苗它就相当于把一份关于特定病毒蛋白的指令交给了人体的免疫系统，让人体免疫系统再去触发。根据中心法则去触发人体产生抗体，这个非常独特，跟我们其他的方式都不一样。

至于好坏的话，其实我这边没有一个特别的定论，有很多好的地方，当然也会有一些不好的地方，这是一个辩证的看法。

为什么mRNA新冠疫苗研究的这么好，而HIV的疫苗我们研究这么久也没有什么大的进展？

Eureka：这是因为其实新冠病毒跟艾滋病毒它有很大的不同，差异涉及抗原、变异和感染机制，不能简单按“新冠比较弱、HIV比较强”来解释疫苗难度。

为什么HIV疫苗更难？新冠刺突蛋白和HIV包膜蛋白都有位于病毒表面的抗体靶点，不能说HIV靶点都在病毒深处。HIV包膜的糖链屏障、结构变化和高度多样性等会妨碍抗体识别，使诱导广泛有效的保护反应更具挑战。

此外HIV它更可怕的一个地方是，相比于新冠来说，它是一种逆转录的病毒。就是说它自己在人体内复制的时候，它很有可能先把自己的RNA逆转录为病毒DNA，再把病毒DNA整合到受感染细胞的基因组中。病毒变异并不是因为与人的DNA“合二为一”才发生，这是非常难以控制的，带来的后果可能是非常可怕的，就是说a患者身体中的HIV病毒跟b患者身体中的HIV病毒已经是两个病毒了，它们产生了各自的变异。所以说你哪怕a患者治疗得好，把这个疗法拿到b患者上去用，疗效需要结合耐药等因素评估，不能因此断定常规抗病毒治疗无法跨患者有效，这就很棘手，意味着我们按照经典路线设计出来的中和抗体，很有可能在一段时间之后就对某一个特定的患者失效了。

另外HIV病毒它相比于新冠病毒来说，它会主动的攻击人类的T细胞，进一步降低人体免疫力。等于说这个病毒本来就毒性很大，降低了人体的免疫力，人体就更加难以产生足够的抗体或者说来发现HIV病毒了。

新冠与HIV和免疫系统的相互作用不同，不能简单按“傻白甜”或强弱来概括。许多新冠感染者能够恢复并产生免疫反应，但这不保证预防下一次感染，也不排除重症和长期后果。HIV可损伤免疫系统并发生变异，通常不能自行清除；抗病毒治疗能有效控制病毒，但不等于治愈。不同人的抗体和治疗经验也不能简单套用，这些都是疫苗与治疗研究需要面对的难题。

不过另外要多说一句，对HIV病毒，我们目前虽然没有一个非常好的solution，但已经有了很多有价值的技术积累，乐观地说，一旦产生了一个革命性的突破方案能串联起这些已有的技术，很可能会产生一个技术爆炸的效应，把目前我们已经stuck在那里的很多年的一些问题一下解决掉。这不光是指治疗HIV病毒，甚至其他的非常棘手的病毒也会迎刃而解，所以尽管我们还是要再等待一段时间，但是至少我个人认为前景应该还是比较乐观的。